Краткая справка по быстрому редактированию ДНК

«CRISPR для чайников» или «Краткая справка по быстрому редактированию ДНК» — это краткое объяснение технологии быстрого и точного редактирования ДНК, которая может быть понятна людям без специального образования в области генетики. Эта статья это простое объяснение быстрой и точной технологии редактирования ДНК, предназначенное для людей без специального образования в области генетики. Она поможет понять основные концепции и принципы этой технологии, а также ее потенциальное влияние на медицину, сельское хозяйство и другие области.

Автор: Борислав Козловский

Ключевые слова статьи: crispr-cas9, crispr что это, crispr/cas9 что это, crispr простыми словами, crispr терапия, crispr/cas9 применение, crispr/cas9 как работает, crispr перевод.

Слово CRISPR переводится как «кластер регулярно распределенных коротких повторений» на русский язык. Термин описывает особый вид иммунитета бактерий, основанный на сохранении коротких участков иностранной ДНК и использовании их для опознавания и уничтожения иностранного генетического материала. Эта технология стала основой для развития современной методики редактирования генома.

Cas9 — это белок, который используется вместе с технологией CRISPR для точного и быстрого редактирования генома. Белок Cas9 является эндонуклеазой, то есть ферментом, который способен разрезать двухцепочечную ДНК в определенном месте. Вместе с РНК-матчером, который определяет целевой участок ДНК, Cas9 может срезать участок ДНК и заменить его на другой участок с нужной последовательностью нуклеотидов. Благодаря своей высокой точности и эффективности, Cas9 стал ключевой компонентой в современных методах генной инженерии и биотехнологии.

CRISPR является священным Граалем биотехнологии и медицины, позволяющим быстро и эффективно изменять фрагменты ДНК. Сравнительно с предыдущими методами, работающими как на пишущей машинке, CRISPR позволяет работать на MacBook. Открытие этой технологии в 2020 году было удостоено Нобелевской премии по химии. В этой статье описывается история появления CRISPR, ее принцип работы и возможные применения, включая изменение геномов животных и растений. Это переработанная версия лекции Бориса Климовича, проведенной в конце ноября с поддержкой Точки кипения ЯрГУ, научного сотрудника Университетской клиники Тюбингена и Немецкого центра исследований рака (DKFZ).

CRISPR был признан в 2012 году, после публикации нобелевской работы, но это открытие не было заслугой пары авторов. На самом деле, множество людей принимало участие в событиях, и все началось не с генетики. В конце 1980-х аспирант Франсиско Мохика изучал архебактерий, живущих в соленой воде рядом с испанским городом Аликанте, и обнаружил палиндромные последовательности в их геноме, которые повторялись много раз. На тот момент никто не знал, какую функцию выполняют эти структуры, но было предположено, что они связаны с регуляцией. Структуры получили название SRSR, а позже переименовали в CRISPR. Мохика нашел аналогичные повторы у многих других бактерий, и в 2002 году у всех бактерий были обнаружены структуры, похожие на CRISPR-массивы, которые были названы CAS (CRISPR-Associated Genes).

Эти гены, обнаруженные рядом с CRISPR-массивами, привлекли внимание группы ученых из Университета Беркли. В частности, Дженнифер Даудна и Эммануэля Шарпентье начали исследовать эти гены, чтобы понять, как они связаны с повторяющимися последовательностями в геноме бактерий.

В 2012 году Даудна и Шарпентье представили механизм работы CRISPR/Cas9, который позволяет редактировать гены бактерий путем удаления, замены или вставки новых участков ДНК. Этот метод стал революционным в генетике и открыл новые возможности для лечения генетических заболеваний и создания новых видов растений и животных.

С тех пор CRISPR стал одним из наиболее активно изучаемых направлений в генетике и биотехнологии, и многие ученые работают над улучшением и расширением его возможностей. Важно отметить, что, несмотря на все достижения, использование CRISPR все еще вызывает много этических и юридических вопросов, и его применение должно происходить с осторожностью и осознанностью.

Затем, в 2005 году, исследователи из Голландии опубликовали статью, в которой описали механизм защиты бактерий от вирусов, связанный с CRISPR. Они показали, что повторы CRISPR и соответствующие им уникальные участки ДНК играют ключевую роль в системе иммунитета бактерий.

Согласно этому механизму, бактерии могут запоминать последовательности вирусной ДНК и использовать их для распознавания и уничтожения вирусов в следующий раз, когда они заражают бактерию.

Однако идея использования CRISPR для редактирования генома возникла только спустя несколько лет. В 2012 году, Дженнифер Даудна и Эммануэль Шарпентье, работая совместно в Университете Беркли, впервые продемонстрировали, что CRISPR-система может быть использована для точечной замены одного гена на другой.

Этот эксперимент стал началом новой эры в биотехнологии, и с тех пор методы CRISPR стали широко использоваться для редактирования генома различных организмов, в том числе человека.

В дальнейшем исследования касательно CRISPR массивов и связанных с ними генов CAS проводились многими учеными в разных странах, в том числе в США, Канаде, Европе и Азии. Эти исследования позволили понять, что система CRISPR/Cas используется бактериями для защиты от инфекций вирусов и других мобильных генетических элементов.

Бактерии могут защититься от вирусов благодаря специфическому механизму, включающему в себя несколько этапов. Сначала бактерии захватывают фрагменты ДНК вирусов, которые они успели поймать и победить ранее, и вставляют их в свой собственный геном в виде CRISPR массивов. Затем, когда бактерия встречает этот же вирус еще раз, RNA молекулы, производимые из генов CAS, находят и разрезают ДНК вируса, что позволяет бактерии эффективно защитить свой геном от вирусных атак.

Открытие этой системы открыло новые возможности для генетики, позволяя использовать ее для точного редактирования генома разных организмов, в том числе человека. CRISPR/Cas стала одним из самых обсуждаемых и перспективных методов генной терапии, который может помочь избавиться от многих генетически обусловленных заболеваний.

Во время исследований было обнаружено, что фрагменты CRISPR можно найти в ДНК бактериофагов — вирусов, которые инфицируют бактерии и могут уничтожить их. Это означает, что бактерии сохраняют внутри себя информацию о своих опасных врагах. Была предположена гипотеза, что CRISPR является иммунной памятью бактерий, которые хранят информацию о вирусах, которыми они заболели. Мохика сформулировал эту теорию и написал статью, которую отправил в журнал Nature. Однако, статью отклонили. Затем он пробовал опубликовать ее в четырех других журналах, но только через 18 месяцев ему удалось это сделать. Кстати, это не рекорд. Линн Маргулис, предложившая гипотезу симбиогенеза, отклоняли 15 раз. Однако, Мохика был более удачливым, его статью опубликовали быстрее и его идея нашла поддержку.

Основная функция CRISPR

Филипп Хорват, микробиолог, продвинул технологию еще дальше, обнаружив основную функцию CRISPR. В своей докторской диссертации он изучал процесс брожения эльзасской квашеной капусты, сфокусировавшись на молочнокислых бактериях, ответственных за этот процесс.

После защиты докторской диссертации, Филипп Хорват присоединился к молочной промышленности, где столкнулся с проблемой бактериофагов, которые серьезно повреждали заквасочные культуры, приводя к значительным потерям производителей молочных продуктов. Хорват искал способы сделать закваски устойчивыми к бактериофагам и обнаружил работы по CRISPR. Изучая эту тему, он доказал, что бактерии, устойчивые к вирусам, могут приобретать части их ДНК.

Когда бактериофаг инфицирует бактерию, которая не умирает, она режет геном вируса на маленькие кусочки, затем встраивает их в CRISPR-массивы и передает эту информацию своим потомкам, которые становятся устойчивыми к бактериофагу. Компанию, где работал Хорват, позже купила DuPont, которая производит около 40% заквасок для молочной промышленности, что означает, что CRISPR используется в производстве многих молочных продуктов, таких как йогурты, пицца и сыр.

Работы Хорвата подтвердили, что CRISPR-массивы являются иммунной системой бактерий. Кусочки ДНК бактериофага сохраняются в виде CRISPR-массивов в ДНК бактерий, затем они превращаются в РНК. В этом же участке генома бактерий кодируется так называемая тракр-РНК (tracrRNA). Вместе они формируют guideRNA, или наводящую РНК, которая затем соединяется с белком Cas9. Cas9 является нуклеазой, ферментом, который способен резать ДНК. При помощи guideRNA этот фермент нацеливается на специфический сегмент в ДНК бактериофага, садится на него и разрезает его, что прерывает размножение вируса.

Когда на конференции в Коста-Рике встретились две талантливые женщины-ученые — Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна, система CRISPR уже была известна научному сообществу. Однако у них возникла смелая идея использовать эту систему для редактирования любой ДНК. Лаборатории ученых объединили усилия, и в 2012 году результаты их работы были опубликованы в журнале Science. Эта работа была отмечена Нобелевской премией по химии в 2020 году.

Две ученые Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна объединили две РНК в одну single guide RNA и успешно продемонстрировали работу механизма резки с помощью CRISPR, генетических ножниц, которые используются в процессе редактирования ДНК. Эта работа была опубликована в журнале Science в 2012 году. За свои достижения в этой области, ученые были удостоены Нобелевской премии по химии в 2020 году. Это уникальное событие было особенно значимо, так как это первая премия, которую получили две женщины без сопровождающей мужской компании, а также из-за быстроты присуждения премии после публикации статьи — всего восемь лет.

Технология CRISPR имеет огромное влияние на современную науку, что подтверждается ростом частоты упоминаний этой аббревиатуры в научной литературе с 2012 года. Эта технология изменила подход к редактированию генома и привела к большому количеству патентов. Ученые работают над оптимизацией процесса редактирования ДНК, чтобы сделать его совместимым с живыми клетками, имеющими ядра, и уже существует оптимизированный процесс, разработанный Фэном Чжаном из MIT.

После опубликования работы Чжана в 2013 году, эта тема стала главной в биологии. Были сообщения о редактировании геномов различных модельных объектов, таких как люди, мыши, дрожжи, нематоды, дрозофилы, резуховидки Таля и рыбки данио-рерио.

Важно отметить, что ДНК является очень стабильной молекулой, которую можно кипятить или оставлять лежать в земле на сотни тысяч лет. На сегодняшний день, самая древняя секвенированная ДНК имеет возраст 1,7 млн лет.

Тем не менее, молекула ДНК очень чувствительна к разрывам, и если такое происходит, клетка запускает процесс ее ремонта, который может пройти двумя путями:

• Не гомологичный ремонт — это процесс, при котором место разрыва восстанавливается с дефектами, что может привести к маленькой вставке или потере фрагмента ДНК. Генетический код представлен типлетами, где три нуклеотида кодируют одну аминокислоту. Если было вырезано два или вставлено четыре нуклеотида, последовательность, кодирующая белок, будет нарушена. Это может вызвать сдвиг рамки считывания, что приведет к неработоспособности гена, поскольку клетка не сможет использовать его информацию для синтеза функционального белка.

Раньше можно было ломать гены, но этот процесс был довольно трудоемким и включал в себя облучение генов радиацией и многомесячный поиск мутаций. С появлением технологии CRISPR этот процесс стал намного проще.

В результате гомологичной рекомбинации клетки используют вторую копию поврежденной хромосомы для восстановления поврежденного участка ДНК. Если вторая копия отсутствует или недоступна, клетку можно обмануть, внедрив в нее фрагмент ДНК с мутацией, который будет использоваться для восстановления поврежденной области, используя его как матрицу. Технология CRISPR позволяет вносить строго определенные мутации в геном, заменять фрагменты ДНК и восстанавливать сломанные гены. Однако, репарация происходит главным образом по не гомологичному пути. Несмотря на различные методы, которые могут сдвинуть процесс в сторону гомологичной репликации, они пока не обладают высокой эффективностью.

Ранее были разработаны технологии редактирования генома, но они требовали создания индивидуальных белков на заказ, известных как кастомные белки. Для каждой операции необходимо было создавать новый белок, что занимало недели или даже месяцы, а стоимость такого белка составляла несколько тысяч евро. В свою очередь, CRISPR-реагенты значительно дешевле — стоят от 10 до 20 евро, что в сотни раз меньше. Это позволило проводить эксперименты гораздо быстрее и в гораздо больших масштабах. Если у вас возникает хорошая идея в воскресенье, то через неделю вы уже можете иметь клеточную линию с необходимыми мутациями и проверить свою идею.

Это, естественно, стало движущей силой в развитии биотехнологий и промышленности. Тысячи компаний пытаются коммерциализировать CRISPR. Одновременно с этим ведется патентная война между MIT и Университетом Беркли, где работает Дженнифер Даудна.

Применение CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 является мощным инструментом для изменения генома. Он позволяет сломать, починить или заменить практически любой ген в геноме, что позволяет биологам ломать гены, чтобы выяснить, как они работают. Особенно важным применением CRISPR-Cas9 является возможность проводить хромосомные перестройки, которые часто возникают в онкологии.

Недавно технология была улучшена путем лишения активности Cas-нуклеазы, делая ее неспособной вызывать разрывы в ДНК. Кроме того, к CRISPR-Cas9 были присоединены другие ферменты, что позволило ей изменять азотистые основания без повреждения ДНК, что очень важно для биомедицинских исследований.

Ученые также научились редактировать эпигеном, активируя или репрессируя работу генов. Это включает метилирование некоторых генов и взаимодействие специальных белков, называемых гистонами, с ДНК. CRISPR-Cas9 позволяет ученым воздействовать на эти процессы и изучать их.

Более того, при помощи CRISPR-Cas9 можно проводить высокоточную микроскопию участков генома. Это создает огромные возможности для исследования и расширения границ науки. CRISPR-Cas9 представляет настоящую революцию в технологии, которую раньше было трудно представить.

Редактирование генов применяется не только для животных и растений, но и для других целей. Например, гены у коров породы, которые раньше были черно-белыми, теперь могут делать пятна серо-белыми, чтобы животные лучше переносили жару.

В Китае провели эксперименты с породой биглей, которым добавили мышечную массу, хотя цель этой работы не совсем ясна. Возможно, китайские ученые имеют свое понимание идеала.

Использование свиней в качестве доноров органов для пересадки всегда было проблемой, потому что у них в геноме много спящих ретровирусов, которые могут стать активными после пересадки и привести к проблемам со здоровьем. На фотографии свиньи, геном которых был отредактирован для инактивации этих фрагментов.

Также с помощью CRISPR были отредактированы гены томатов: изменили количество ветвлений на ветке и размеры плодов, как показано на фотографии.

Количество редактированных животных и растений уже очень велико, что подтверждается большим количеством научных статей на эту тему.

CRISPR-модифицированных продуктов в магазинах пока не встретить, по крайней мере в Европе. Это обусловлено предельной осторожностью регуляторов, хотя, по моему мнению, это излишне. Ранее генетически модифицированные продукты были запрещены в Европе из-за неизвестности последствий, которые могут произойти, если такие растения попадут в природную среду. Возможно, генетически модифицированная кукуруза, например, уничтожит все березы в лесу. Кроме того, неизвестно, как такие продукты повлияют на здоровье людей в долгосрочной перспективе, поскольку в процессе модификации использовались генетические элементы из других организмов.

Однако CRISPR позволяет вносить мутации без оставления следов, так как внедряемые РНК и белки в клетке деградируют. От них ничего не остается, сохраняется только сама мутация. Фактически, CRISPR делает то же самое, что и происходит при естественной селекции. Тем не менее, регуляторы продолжают проявлять излишнюю осторожность и пока не разрешают использование CRISPR.

«Я, как ученый, считаю, что CRISPR следует разрешить, и тогда мы можем ожидать настоящего взрыва технологического развития. С помощью CRISPR мы можем решить множество проблем, в том числе связанных с глобальным потеплением. Например, мы можем создать засухоустойчивые и более продуктивные сорта растений, которые позволят использовать меньше земли, не применять пестициды или удобрения.»

CRISPR и его применение в биомедицине

Одним из самых захватывающих аспектов использования CRISPR в биомедицинских исследованиях является его потенциальная способность улучшить жизнь людей, страдающих от различных заболеваний. Однако, доставка «генетических ножниц» в клетки человека остается главной сложностью данного процесса. Например, для того, чтобы исправить неработающий ген, который вызывает болезнь, необходимо вмешаться в работу всего органа или даже всего тела.

Например, если мы хотим исправить мутацию, вызывающую диабет, нам необходимо вмешаться в работу всей поджелудочной железы. Однако, это довольно сложно, поскольку клетки организма умеют эффективно защищаться от вторжения чужеродной ДНК. Поэтому, исследователи начали с того, что можно было вынуть из организма, отредактировать в пробирке, размножить и затем вернуть обратно – таких как костный мозг и кровь.

Вот как CRISPR используется для лечения бета-талассемии и серповидно-клеточной анемии. Эти болезни вызываются двумя различными мутациями в гене бета-гемоглобина. Больные бета-талассемией нуждаются в частых переливаниях крови, в то время как у больных серповидно-клеточной анемии эритроциты забивают сосуды, что приводит к низкому качеству жизни и риску преждевременной смерти.

CRISPR может помочь в такой ситуации, поскольку у человека есть третий ген гемоглобина, который называется фетальный гемоглобин и активен только у эмбрионов до рождения. После рождения он перестает работать, и взрослые альфа- и бета-гемоглобины начинают функционировать. С помощью CRISPR можно включить ген фетального гемоглобина, выключив ген, который его контролирует.

Две больные женщины были подвергнуты процедуре, в которой им были забраны клетки костного мозга, затем в них была введена CRISPR-конструкция при помощи вируса, которая была способна выключить ген BCL11A. В результате этой манипуляции, в клетках начал функционировать фетальный гемоглобин. После того, как эти отредактированные, выбранные и размноженные клетки были возвращены обратно пациентам, их же костный мозг был пересажен. Как следствие, пациентке с бета-талассемией, которая требовала в среднем 16 переливаний крови ежегодно, не потребовалось ни одной процедуры в течение года. Аналогичный эффект был достигнут у больной серповидноклеточной анемией, что фактически привело к их излечению.

Эти исследования перешли на следующую стадию клинических испытаний, и в ближайшее время этот метод может стать широко распространенным.

Следующее направление работы связано с терапией ВИЧ. Некоторые люди не заражаются вирусом иммунодефицита человека из-за мутации в гене CCR5 — делеции в 32 нуклеотида. Если у человека обе копии гена мутированы, то вирус не может проникнуть в их клетки.

У некоторых пациентов на фоне ВИЧ возникает лимфобластный лейкоз (рак крови). Если другие методы лечения не эффективны, больным лимфобластным лейкозом часто пересаживают костный мозг. В таких случаях используется костный мозг донора, который подходит для лечения лейкемии.

Перед пересадкой клетки костного мозга редактировали с помощью CRISPR, чтобы выключить ген CCR5 — они повторили мутацию, которая уже существует в природе. Это привело к тому, что пересадка вылечила пациента и от лейкоза, и от ВИЧ.

По моему мнению, это один из наиболее заметных примеров возможностей CRISPR.

CRISPR и вопросы этики Когда речь заходит о ВИЧ, трудно не вспомнить самый громкий случай использования CRISPR. Это произошло в 2018 году, когда китайский ученый Цзянькуй Хэ провел эксперимент по редактированию генов человеческих эмбрионов.

За этот эксперимент с редактированием ДНК человека Цзянькуй Хэ был приговорен к трем годам тюремного заключения. Он занимался ЭКО и получил эмбрионы от пар, в которых отцы были инфицированы ВИЧ, и попытался с помощью CRISPR выключить в них ген CCR5. В результате эксперимента родились трое внешне здоровых детей.

Однако эксперимент привел только к частичному редактированию генов. У одной девочки первая копия гена была редактирована с 15-нуклеотидной делецией, что оказалось недостаточно, чтобы ген перестал функционировать. А вторая копия гена не была изменена вовсе. К сожалению, девочка не получила никакой защиты. С другой девочкой все прошло лучше, но ген все равно остался частично функциональным.

Проблема этого эксперимента заключается в нарушении этических норм и законов. Оказалось, что Цзянькуй Хэ подделал разрешение этической комиссии, которая не одобрила это исследование. Во всех странах нормальные ученые подобного рода эксперименты запрещены, но он решил их проигнорировать. Кроме того, эксперимент был плохо подготовлен, и исследователь не учел возможные риски. Редактирование генов прошло неудачно, и последствия этого эксперимента могут проявиться в будущем. CRISPR не обладает абсолютной точностью, и он может вносить мутации в других местах генома. Предсказать, где именно это произойдет, достаточно сложно.