Редактирование генома, или crispr/cas9 — панацея от многих неизлечимых болезней или первый шаг к генному апокалипсису?
Читать в PDF [UA] | Читать в PDF [RU]
Авторы статьи:
КОМИСАРЕНКО Сергей Васильевич — академик НАН Украины, директор Института биохимии А.В. Палладина НАН Украины;
РОМАНЮК Светлана Ивановна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института биохимии А.В. Палладина НАН Украины.
Странца авторов →
Краткий обзор
В обзоре говорится об истории открытия, бурном развитии и дальнейших перспективах применения нового мощного инструмента для перспективах применения нового мощного инструмента для редактирования генома — CRISPR/Cas9. Взяв за основу один из элементов защитной системы бактерий, ученые-биологи создали достаточно простой, дешевый и быстрый метод внесения изменений в ДНК растений, животных и человека. Никогда раньше человечество не имело столь точного орудия для манипуляции генами, и это открывает широкие возможности для профилактики и лечения многих заболеваний. В то же время в обществе ведутся острые дискуссии: благо или зло Как и любая новая технология, генное редактирование вызывает опасения и поднимает ряд серьезных этических проблем, особенно в отношении возможности его использования на клетках зародышевой линии и геноме эмбрионов человека. Однако уже сейчас очевидно, что CRISPR/Cas9 — это это не очередная модная «игрушка» для ученых, а революционная технология, которая изменит наше будущее.
Keywords(ключевые слова): CRISPR/Cas9, редактирование геномной ДНК, генная терапия, генетически модифицированные организмы.
История науки знает множество примеров, когда случайное открытие в непопулярной науке приводило к научному прорыву, который делал возможным осуществление самых заветных мечтаний человечества. Так были открыты антибиотики, рентгеновское излучение и т.д. Вот и сейчас мы являемся свидетелями развертывания подобной научной революции в генетике. Кажется, у генетиков появился инструмент, способный в короткие сроки сделать научную фантастику реальностью. Научное сообщество активно обсуждает перспективы лечения рака и неизлечимых наследственных заболеваний путем удаления из организма дефектных генов. В геометрической прогрессии растет количество научных статей на эту тему, в прессе постоянно появляются сообщения, интервью, ведутся дискуссии.
Виновниками такого «переполоха» являются авторы неожиданного открытия, которые в 2012 году разработали метод CRISPR/Cas9 для точного редактирования генома живых организмов.
Открытие CRISPR/Cas9 уже отмечено множеством научных наград и, безусловно, заслуживает самой престижной научной награды — Нобелевской премии. Основная часть этой статьи была написана несколько лет назад как предвестник этого события. Однако Нобелевский комитет по разным причинам пока не торопится принимать положительное решение, в том числе, вероятно, из-за судебной тяжбы относительно патентования этой методики, которая продолжается в последние годы. Несмотря на это, практическое применение технологии CRISPR/Cas9 с каждым годом становится все более широким и имеет многочисленные достижения в области биотехнологии и медицины, значение которых для человечества трудно переоценить. Поэтому, на наш взгляд, важно и интересно рассмотреть основные направления и перспективы развития этой технологии, а также обозначить существующие проблемы.
История открытия CRISPR/Cas9
С чего же началась история открытия CRISPR/Cas9? Как не удивительно, с исследований противовирусного иммунитета бактерий. В 50-х годах XX века ученые обратили внимание на то, что некоторые штаммы бактерий легко заражаются вирусами, а другие штаммы того же вида — устойчивы к заражению. Двадцать лет исследований дали свои результаты: выяснилось, что устойчивость определенных бактериальных штаммов к вирусам объясняется наличием у бактерий специальных ферментов — рестриктаз (от лат. restrictio — ограничение), которые разрезают вирусную ДНК.
Интересной особенностью этих ферментов является их четкая специфичность к определенной небольшой последовательности ДНК. Собственную ДНК бактерия защищает от рестриктаз с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина. Первую рестриктазу (EcoK) в 1968 году выделили Мэтью Мезельсон (Matthew Meselson) и Роберт Юань (Robert Yuan) [1]. Способность этих ферментов «резать» ДНК в четко определенной точке была использована учеными для получения нужных фрагментов геномной ДНК. В 1978 году за открытие рестриктаз и их применение в молекулярной генетике Вернеру Арберу (Werner Arber), Гамильтону Смиту (Hamilton O. Smith) и Даниэлу Натансу (Daniel Nathans) была присуждена Нобелевская премия. А в 1967 году Бернард Вейсс (Bernhard Weiss) и Чарльз Ричардсон (Charles Richardson) впервые обнаружили специальные «шивающие» ферменты — ДНК-лигазы [2]. Использование лигаз и рестриктаз позволило создавать искусственные конструкции из ДНК живых организмов. Так появилась новая область науки — генная инженерия, которая дала возможность создавать генно-модифицированные организмы (ГМО), рекомбинантные протеины, индуцированные стволовые клетки и т.д. Что такое CRISPR/Cas9? И что это имеет отношение к противовирусному иммунитету бактерий? Оказалось, что бактерии защищаются от вирусов не только с помощью рестриктаз, поскольку вирус может не иметь в своей ДНК последовательности, необходимой для расщепления этими ферментами. Существует и другой, более эффективный механизм, который обеспечивает бактериям специфическую защиту после встречи с определенным вирусом. Этот механизм реализует система с довольно громоздким названием CRISPR/Cas9, или «криспер».
Когда ДНК вируса проникает в бактерию, происходит копирование фрагмента этой ДНК и перенесение его в специальное «хранилище» информации о вирусах в собственном геноме — CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами). Здесь образцы ДНК разных вирусов (спейсеры) накапливаются между одинаковыми короткими повторами бактериальной ДНК и используются для изготовления CRISPR РНК — сrРНК (их также называют РНК-зондами или РНК-гидами), которые специфически распознают гены определенных вирусов и связываются с ними при повторном заражении. Благодаря сrРНК вирусную ДНК находят специальные ферменты — протеины Cas (CRISPR-ассоциированные протеины), гены которых находятся рядом с массивом CRISPR. Эти ферменты, как и рестриктазы, являются эндонуклеазами, то есть они могут разрезать ДНК вируса, уничтожая ее. Рассмотрим подробнее, как именно работает система CRISPR/Cas9.
Рассмотрим более подробно, как именно работает система CRISPR/Cas9. Лидерная последовательность CRISPR играет роль промотора, с которого начинается транскрипция всего массива. Возможно, она также распознается протеинами, которые вставляют в CRISPR новые спейсеры. После транскрипции массива CRISPR образуется длинная молекула РНК, к которой присоединяется небольшая РНК, комплементарная повторам (tracrРНК); к tracrРНК присоединяется протеин Cas9, который активируется при взаимодействии, а к Cas9, в свою очередь, присоединяется фермент РНКаза III, который разрезает длинную РНК на фрагменты — сrРНК и отсоединяется. В Streptococcus pyogenes, например, сrРНК, которые образовались, состоят из 42 нуклеотидов: 22 конечных нуклеотидов — это половина палиндромного повтора, а остальные 20 — уникальный спейсерный фрагмент. Фактически в результате разрезания длинной РНК образуется комплекс crРНК, tracrРНК и активированного протеина Cas9. Спейсерная часть crРНК распознает комплементарный участок вирусной ДНК, а протеин Cas9 закрывается на двух нитях ДНК и «разрезает» их, вызывая дальнейшую деградацию чужеродной ДНК [3].
Для успешного распознавания ДНК-«мишеней» и её повреждения необходимо, чтобы протеин Cas9 распознавал определенную короткую (3-9 нуклеотидов) последовательность PAM (Protospacer Adjacent Motif — мотив, который примыкает к протоспейсеру), которая находится рядом с распознанной crРНК долей ДНК. В разных видах бактерий эта последовательность разная; например, для Streptococcus pyogenes последовательность PAM — 5′-NRG3′ (где N — любой нуклеотид, а R — A или G).
Для чего нужно распознавание PAM? Есть предположение, что отсутствие последовательностей PAM в составе собственных генов бактерии защищает их от разрезания системой CRISPR/Cas9, так как CRISPR содержит 20% спейсеров, нацеленных на собственную ДНК [4]. Зачем эти спейсеры сохраняются, неизвестно. Возможно, у бактерий есть какой-то механизм регуляции транскрипции собственных генов, в который вовлечены CRISPR и специальные белки.
Кто же открыл систему CRISPR/Cas9? Споры по этому вопросу продолжаются и по сей день. Ведь в современной науке уже невозможно открыть что-то односторонне. История открытия, которая вызвала революцию в генной инженерии, продолжалась в течение 25 лет, и многие ученые внесли в нее свой вклад. В 1987 году японские ученые под руководством Йосидзуми Исино (Yoshizumi Ishino) вместе с геном iap, который они исследовали, случайно клонировали довольно большой фрагмент генома кишечной палочки Escherichia coli, который не кодировал ни одного белка [5].
Это было очень странно, так как бактерии, как правило, не имеют лишних последовательностей. Участок состоял из повторяющихся последовательностей ДНК и вариабельных фрагментов ДНК между ними — спейсеров [6]. В 1993 году ученые из Нидерландов под руководством Яна ван Эмбдена (Jan D.A. van Embden) исследовали разнообразие перерывных прямых повторов среди разных штаммов возбудителя туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) и разработали новый метод дифференциации штаммов, который используется и по сей день [7].
Позднее, испанец Франсиско Хуан Мартинес Мохика (Francisco Juan Martínez Mojica) обнаружил похожие участки в других видах бактерий и архей, и в 2000 году предложил объединить их в семейство под названием SRSRs (Short Regularly Spaced Repeats — короткие регулярно расположенные повторы) [8], которое через два года переименовали в CRISPR. Тогда же, в 2002 году, группа ученых из Нидерландов во главе с Руудом Янсеном (Ruud Jansen) открыли гены протеинов Cas, расположенные рядом с участком CRISPR [9]. А в 2005 году сразу три исследовательские группы независимо друг от друга выяснили, что между повторами CRISPR часто находятся последовательности, идентичные последовательностям ДНК вирусов-бактериофагов и плазмид [10-12]. Эти результаты и предположения о выполнении CRISPR функции противовирусной защиты не вызывали тогда особого интереса. Все изменила научная статья, которая вышла в журнале Science в 2007 году [13].
Её авторами была группа ученых под руководством Филиппа Хорвата (Philippe Horvath) из компании Danisco (США) — производителя известных йогуртов Danone (в 2011 году Danisco приобрела компанию DuPont за $6,3 млрд). Дело в том, что при производстве кисломолочных продуктов есть опасность заражения молочнокислых бактерий вирусами-бактериофагами, что может привести к огромным убыткам. Поэтому в компании Danisco решили отобрать для производства клоны молочнокислых бактерий, устойчивых к вирусу. А поскольку компания использовала CRISPR для классификации своих коммерческих штаммов, ученые сразу заметили, что в участках CRISPR отобранных клонов появлялись новые спейсеры, которые были идентичны участкам вирусного генома.
Исследователи искусственно вставили спейсер с последовательностью ДНК вируса в участок CRISPR бактерии, что сразу же сделало ее устойчивой к вирусу.
В 2007-2008 гг. были открыты важные детали механизма работы CRISPR. Группа под руководством Джона ван дер Ооста (John van der Oost), например, показала, что защита CRISPR реализуется через малые РНК [14]. Лучиано Марраффини (Luciano A. Marraffini) и Эрик Сонтгеймер (Erik J. Sontheimer) из Северо-Западного университета в Эванстоне (штат Иллинойс, США) доказали, что система CRISPR направлена на разрезание ДНК [15]. Они первыми высказали мысль о возможности использования CRISPR для редактирования генома в гетерологических системах и даже подали заявку на патент, но из-за недостаточности экспериментального подтверждения в конечном итоге отказались от него [16].
Затем стало известно, что для выполнения защитной функции CRISPR необходимо взаимодействие с многими протеинами Cas, одни из которых связываются с малыми РНК, другие распознают ДНК вируса, а третьи ее разрезают. Однако французская исследовательница Эммануэль Шарпентье (Emmanuelle Charpentier), которая работает в основном в Германии и Швеции, выявила разновидность системы CRISPR, которая для полноценной защиты требовала только одного очень большого протеина Cas — его назвали Cas9. В 2012 г. Мартин Джинек (Martin Jinek) из группы Дженнифер Дудны (Jennifer Doudna) из Калифорнийского университета в Беркли (University of California, Berkeley) объединил tracrРНК и crРНК в одну единую молекулу ѕgРНК (single-guide RNA — единая РНК-гид) и создал вектор для клонирования этой РНК. Оказалось, что такая синтетическая ѕgРНК корректно работает в клетке в комплексе с протеином Cas9.
Тогда научные группы Э. Шарпантье и Дж. Дудни опубликовали статью в Science [17], в которой предложили способ использования системы CRISPR/Cas9 для разрезания выбранных исследователем ДНК-«мишеней» в клетке и продемонстрировали возможность такого подхода в экспериментах in vitro. Почти одновременно с ними подобную статью опубликовала группа литовского биохимика Виргиниуса Шикшниса (Virginijus Siksnys) из Института биотехнологии Вильнюсского университета [18]. Интересно, что работа Шикшниса была выполнена ранее, но ее публикация задержалась на полгода из-за необоснованного отклонения в журнале Cell.
В начале 2013 года группы Джорджа Черча (George Church) [19] и его бывшего аспиранта Фена Чжана (Feng Zhang) [20] из Института Броуд (Broad Institute of MIT and Harvard) в Кембридже показали, что искусственная crРНК и протеин Cas9 полноценно функционируют в клетках высших организмов. Практически одновременно эффективность такого подхода подтвердили ученые из Южной Кореи в экспериментах с культурой клеток человека [21]. Сразу после этого все забыли о проблемах бактерий в их непростой борьбе с вирусами. Казалось, что научные и общественные издания «взорвались» публикациями исключительно на одну тему: про CRISPR/Cas9 как фантастический инструмент для редактирования геномов высших организмов.
Речь в том, что эта технология оказалась намного лучше предыдущих методов генной инженерии. Ранее при создании ГМО ученые не имели возможности контролировать, куда именно в геноме и в каком количестве встраивается вирусный вектор с геном-вставкой. Чтобы получить необходимый результат, нужно было провести очень трудную и длительную работу, отбрасывая значительное количество неудачных вариантов. Технология CRISPR/Cas9 предложила простой способ встраивать ген-вставку в определенную последовательность ДНК. Кроме того, эта технология позволяет работать в клетках всех организмов — от бактерий до млекопитающих. Систему CRISPR/Cas9 можно использовать не только в пробирке, как рестриктазы, но и непосредственно в живой клетке. Можно одновременно редактировать неограниченное количество генов в геноме, а также вводить компоненты системы не только в отдельные клетки, но и в целые ткани или весь организм. Безусловные преимущества CRISPR/Cas9 значительно сокращают продолжительность генной инженерии и позволяют уже сейчас рассматривать реальную возможность применения этой системы для модификации эмбрионов человека, лечения рака или наследственных заболеваний.
Конечно, есть и другие инструменты для редактирования генома, а именно: мегануклеазы, TALEN и нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN — Zinc-Finger Nucleases). Мегануклеазы — это природные ДНК-нуклеазы, которые есть у фагов, бактерий, грибов, водорослей и некоторых растений. Они кодируются мобильными генетическими элементами и распознают большие участки ДНК (12-40 пар оснований), благодаря чему их считают наиболее специфичными природными рестриктазами.
С момента открытия в 1990-х годах наиболее известными стали мегануклеазы I-SceI, I-CreI и I-DmoI семейства LAGLIDADG (название происходит от характерной для этих протеинов последовательности). Эти небольшие протеины встречаются в митохондриях и хлоропластах эукариотических одноклеточных организмов и известны своими плотно упакованными трехмерными структурами. Однако мегануклеазы не получили широкого применения в генной инженерии, так как довольно сложно подобрать среди них фермент, который разрезал бы ДНК в нужном месте. Сейчас ученые пытаются создать более совершенные генно-инженерные мегануклеазы и их гибриды с другими протеинами [22].
Системы редактирования генома TALEN и ZFN
Системы редактирования генома TALEN и ZFN — это генно-инженерные протеины, которые содержат домен ДНК-нуклеазы, разрезающей ДНК, и домены других протеинов, которые после модификации приобретают способность связываться с определенной последовательностью ДНК. В состав протеинов TALEN входит домен протеина TALE (Transcription Activator-Like Effector — эффектор, подобный активатору транскрипции) фитопатогенной бактерии Xanthomonas, а протеины ZFN содержат домен эукариотического фактора транскрипции, в структуре которого есть от 3 до 6 структур так называемых «цинковых пальцев».
Однако использование систем TALEN и ZFN для редактирования генома требует создания отдельного искусственного протеина для каждой новой ДНК-«мишени». В отличие от них, система CRISPR использует универсальный протеин Cas9, и необходимо изменять только sgRNA. Это намного проще и дешевле, так как любую РНК можно легко синтезировать. Еще одним преимуществом системы CRISPR/Cas9 перед другими инструментами редактирования генома является возможность ее применения к РНК, что обеспечивает более гибкие возможности воздействия на биохимические процессы в клетке. Для редактирования одноцепочечной РНК необходимо добавить crRNA, протеин Cas9 и ДНК-олигонуклеотид, содержащий последовательность PAM — PAMmer [23]. Так, в 2016 году было предложено с помощью системы CRISPR/Cas9 отслеживать долю определенных РНК в живой клетке без применения генетических меток — тегов [24].
Биотехнологические компании уже давно продают векторы для удобной доставки в клетку компонентов системы CRISPR/Cas9 с целью редактирования генома. Компания открытого обмена Addgene (Кембридж, США) осенью 2018 г. сделала большой шаг, бесплатно передав более 1 млн плазмид ученым по всему миру, а недавно у них появилась новая услуга — распространение вирусных векторов, прежде всего лентивирусов и адено-ассоциированного вируса (AAV) [25]. Векторы для CRISPR/Cas9 представляют собой кольцевую молекулу ДНК, которая кодирует sgRNA и матричную РНК протеина Cas9. Таким образом, исследователь может разрезать любую последовательность ДНК в клетке, включив в sgRNA соответствующий комплементарный фрагмент. Конечно, необходимо выбрать такую последовательность, которая не повторяется в других участках генома. Затем вектор размножают в клетках специального лабораторного штамма кишечной палочки (где он не считывается из-за несовпадения командных сигналов), выделяют из бактерий и трансформируют им клетки, геном которых хотят изменить.
Ученые всего мира бросились использовать технологию CRISPR/Cas9 для редактирования геномов вирусов, бактерий, животных и растений.
Применение этой технологии к бактериям позволило из смешанной культуры выделять отдельные виды и штаммы. Успешно были модифицированы дрожжи, плодовые мухи, рыбы даньо, шелкопряды, лягушки. Инъекции матричной РНК Cas9 и sgRNA в зародышевые клетки позволили быстро получать генетически модифицированных мышей, крыс, свиней, тхоров, карпов и даже слонов. Следовательно, открылись практически безграничные перспективы создания ГМО для борьбы с болезнями, улучшения пород сельскохозяйственных животных и сортов растений, создания моделей для изучения генетических заболеваний человека и животных, тестирования новых методов лечения и даже создания домашних животных.
Во многих странах, в том числе в США, организмы, модифицированные с помощью CRISPR, не относятся к ГМО, так как они не содержат чужеродной ДНК, и поэтому можно относительно легко получить разрешение на выращивание модифицированных CRISPR-растений и производство из них продуктов питания. Первыми в апреле 2016 года такое разрешение от Министерства сельского хозяйства США получили шампиньоны садовые (Agaricus bisporus), которых с помощью CRISPR лишили способности темнеть при механических повреждениях и терять товарный вид. Модифицированные грибы получил американский ученый Йинонг Янг (Yinong Yang) из Университета штата Пенсильвания. С тех пор разрешение на выращивание было дано еще для 5 организмов, модифицированных CRISPR, в том числе рисового посева (Camelina sativa) — масличной культуры, содержащей больше омега-3 жирных кислот, а также сорта сои, устойчивого к засухе. Скоро планируется выход этих продуктов на рынок.
Почему открытие технологии CRISPR/Cas9 вызвало такой ажиотаж?
Технология редактирования генов способна повысить эффективность сельского хозяйства и помочь прокормить растущее население планеты, уменьшив при этом негативное влияние человека на окружающую среду. Исследователи планируют выращивать кур, не вызывающих аллергии у человека, восстановить численность медоносных пчел, которые пострадали по всему миру от болезней и паразитов. Также предлагают применять CRISPR для контроля пола сельскохозяйственных животных: крупный рогатый скот должен рождаться только бычками, дающими больше мяса; включение гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) в половые хромосомы кур позволит отбраковывать по свечению в ультрафиолете яйца, из которых вылупятся петушки, и использовать их в производстве вакцин. Однако, так как при редактировании генома CRISPR может изменять ненамеренные гены, высказывается предположение, что это может повлиять на здоровье животных, на состав мяса и молока. Поэтому пока что потребители требуют осторожности в применении новых технологий для животных, которых используют в производстве продуктов питания [27].
Возможность модификации геномов экзотических и малоизученных животных вызвала «волну» массового создания новых модельных организмов. Разработка моделей животных требует огромных затрат времени и денег. В 2016 году Национальный научный фонд США запустил программу стоимостью 24 млн долларов для создания новых модельных организмов. Программа поддерживает исследования геномов видов, изучение жизненных циклов организмов и разработку протоколов для содержания этих видов в лаборатории. В рамках программы в марте 2019 года с помощью CRISPR была создана первая генетически модифицированная рептилия — коричневый анолис (Anolis sagrei) [28].
Технология CRISPR стала ценным инструментом фундаментальных исследований, который позволяет «выключать» определенные гены и устанавливать их биологическую функцию в организме. Раскрытие генетических и молекулярных механизмов, которые обусловливают сложные признаки и поведение, является особенно важным для малоизученных видов животных. Так, с помощью CRISPR были идентифицированы гены, которые контролируют узор и цвет крыльев бабочки [29], созданы модифицированные райдерские муравьи (Ooceraea biroi), которые не имеют запаха феромонов и не могут поддерживать сложную иерархию колонии. Технология CRISPR помогла изучить мозговую деятельность головоногих моллюсков (гавайского кальмара бобтейла Euprymna scolopes и карликовой каракатицы Sepia bandensis) во время изменения узоров на коже в зависимости от внешней среды. Ранее подобные исследования не проводились из-за отсутствия у моллюсков костей и невозможности закрепления электродов на голове животного [28].
Инактивировать ген без его повреждения можно с помощью CRISPR-интерференции (CRISPRi). При этом мутантный протеин dCas9, у которого не функционируют оба нуклеазных центра, связывается с ДНК-«мишенью» и мешает продвижению РНК-полимеразы, что приводит к остановке транскрипции [30]. Если к протеину dCas9 «привязать» домен фактора транскрипции, который увеличивает или подавляет активность генов, то можно непосредственно влиять на функционирование генов и работу всего организма. Регулировать активность экспрессии генов можно также, влияя на эпигеномные процессы (например, на метилирование ДНК или ацетилирование гистонов).
Для этого можно использовать искусственные белки, состоящие из dCas9 и каталитического домена соответствующего фермента (ДНК-метилтрансферазы или ацетилтрансферазы гистонов) [31]. «Мишени» системы CRISPR/Cas9 могут быть также длинные некодирующие РНК (lncRNA) или энхансерные РНК (eRNA), которые регулируют экспрессию генов и эпигенетические процессы [32]. Это очень важно для исследования функций регуляторных РНК и установления их роли в патогенезе заболеваний, так как более 90% заболеваний, связанных с однонуклеотидной заменой, содержат эту замену в некодирующих участках ДНК [33]. С помощью CRISPR/Cas9 можно доставлять к мутантным генам белки, способные заменить дефектный ген на его здоровую копию с другой хромосомы, что может стать основой новых методов лечения некоторых заболеваний, например, диабета. А присоединив к белку dCas9 флуоресцентный белок GFP, можно пометить определенный участок в хромосоме живой клетки и наблюдать за ней под микроскопом в течение клеточного цикла или визуально определять длину теломер [34]. В 2019 году в Калифорнийском университете в Беркли был создан биосенсор CRISPR-Chip на основе ультрачувствительного графена и системы CRISPR/Cas9, который позволяет в течение 15 минут обнаруживать определенные последовательности ДНК без ее амплификации с чувствительностью 1,7 фМ (1,7 × 10^-15 Моль) [35]. Немецкие ученые из Университета Фрайбурга разработали электрохимический микрофлюидный биосенсор, который обнаруживает до восьми микроРНК в одном образце с помощью CRISPR/Cas13a.
Этот биосенсор имеет универсальный чип и легко настраивается на обнаружение любой микроРНК. Он может быть использован для ранней диагностики заболеваний человека, так как кластеры из 5-6 микроРНК, как правило, являются хорошим биомаркером, в частности, при болезни Альцгеймера или различных типах рака. Подобные биосенсоры, использующие различные типы фермента Cas, могут направляться на обнаружение специфических последовательностей в одно- или двухцепочечной ДНК и РНК возбудителей инфекционных заболеваний. Такая система, например, способна определять количество РНК коронавируса, его тип (SARS или Covid19) и даже дифференцировать отдельные несоответствия нуклеиновой кислоты [36]. Таким образом, как видим, возможности системы CRISPR/Cas9 не ограничиваются только расщеплением определенных последовательностей ДНК. Эта система является универсальным механизмом доставки любых молекул в любую «точку» генома, что открывает фантастические возможности для медицины и фундаментальной науки.
Ученым, которые внесли наибольший вклад в открытие технологии CRISPR/Cas9, ежегодно пророчат Нобелевскую премию, а в ожидании ее награждают многочисленными другими наградами. Большинство наград собрала Дж. Дудна (29 за последние 6 лет), среди которых: премия Милдред Кон по биологической химии от Американского общества биохимиков и молекулярных биологов (2013), премия Лурье в области биомедицинских наук от Фонда Национального института здоровья, премия «Прорыв» в области наук о жизни, премия доктора Поля Янссена по биомедицинским исследованиям, премия Якоба Хескеля Габбая (2014), награда принцессы Астурийской, премия Грубера в области генетики (2015), премия фонда Уоррена Альперта, премия Пауля Эрлиха и Людвига Дармштедтера, премия Л’Ореаль-ЮНЕСКО для женщин в науке, премия доктора Г.П. Хайнекена по биохимии и биофизике от Нидерландской королевской академии искусств и наук, Международная премия канадского фонда Gairdner, премия Тан Тайваньской академии Sinica (2016), премия Японии, медаль Ф. Альберта Коттона за отличные химические исследования (2017), премия Кавли по нанонауке, Крунианская медаль и лекция от Лондонского королевского общества, премия Перла Мастера Грингарда от Университета Рокфеллера, медаль почета от Американского общества рака (2018), премия Ниренберга (2019), премия Вольфа по медицине (2020) и т.д. Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпентье в 2015 г. вошли в список ста самых влиятельных людей мира по версии журнала Time, в 2016 г. Дж. Дудна стала иностранным членом престижного Лондонского королевского общества, а в 2018 г. вошла в американский список 50 самых выдающихся женщин в области техники по версии журнала Forbes [37].
В январе 2014 года китайские ученые с помощью системы CRISPR/Cas9 модифицировали геном макак. От одной матери родились две обезьянки, которым успешно ввели мутации в ген Ppar-γ, отвечающий за отложение жира, а также в ген Rag1, связанный с работой иммунной системы, а именно с процессом формирования разнообразия антител. После успеха с обезьянками все поняли, что настала очередь человека. И действительно, очень заманчиво, исправив всего одну нуклеотидную основу в ДНК, освободить человека от тяжелого наследственного заболевания, например, гемофилии. Последовательность ДНК длиной в 20 нуклеотидов, которая является «мишенью» для системы CRISPR/Cas9, как правило, не повторяется в геноме человека. После разрезания белком Cas9 ДНК восстанавливается благодаря репарации по образцу правильной копии гена с парной хромосомы. Если парной хромосомы нет (например, при гемофилии ошибка находится в Х-хромосоме, которая у мужчин только одна), то можно ввести в клетку вместе с crРНК и белком Cas9 фрагмент с правильной последовательностью ДНК нужного гена. Кроме того, с помощью CRISPR/Cas9 можно выключать отдельные гены и идентифицировать те, которые отвечают за выживание клеток при раке. И выявив в отдельных клетках организма мутации, которые приводят к развитию рака, можно с помощью CRISPR/Cas9 устранять их. Для быстрого редактирования любых генов человека создана огромная библиотека, содержащая 73 000 разных sgРНК и охватывающая 80-90% всех последовательностей генома [41].
Однак неизвестно, как организм человека отреагирует на вмешательство в геном. Поэтому возможность редактирования генов человека сразу же поставила ряд этических проблем, особенно острых в случае редактирования генов эмбриона человека. Имеют ли право ученые или родители будущего ребенка принимать решение о изменении генов эмбриона, об изменении сущности человека, который должен родиться? Ведь у этого человека никто не спрашивает согласия, потому что он еще не существует. Где гарантия, что принятые сейчас решения окажутся такими разумными, какими они кажутся сейчас? Готовы ли ученые взять на себя ответственность за непредвиденные последствия таких экспериментов? И что вообще случится с человеком, если он начнет изменять свои гены на свое усмотрение? Эти вопросы сейчас являются предметом ожесточенных дискуссий, и пока что у них нет однозначных ответов.
Однако из-за чрезвычайно заманчивых перспектив редактирования генома человека с помощью CRISPR/Cas9 возникли опасения, что его могут начать раньше, чем убедятся в безопасности. Поэтому 24 января 2015 года Дженнифер Дудна собрала в долине Напа в Калифорнии 18 авторитетных генетиков для обсуждения этой проблемы. В конференции принял участие нобелевский лауреат Пол Берг (Paul N. Berg), который организовал в 1975 году на территории Государственного парка-пляжа Асиломар в городе Пасифик Гроув в Калифорнии знаменитую Асиломарскую конференцию, на которой были приняты правила работы в генной инженерии и введен мораторий на использование технологий рекомбинантной ДНК. После этого моратории вводили еще дважды:
В 1997 году были проведены работы по репродуктивному клонированию человека, а в 2012 году были проведены работы по мутагенезу вируса птичьего гриппа. Результаты конференции в Долине Напа были опубликованы 3 апреля 2015 года в журнале Science в виде меморандума, который призывает запретить клинические эксперименты по генетической модификации человека, пока не будут поняты последствия и введены правила [42]. Комментируя выводы конференции в Напе, Джордж Черч точно заметил, что на ней скромно умолчало главный вопрос: «Какой же сценарий нас беспокоит на самом деле: что методы редактирования генома будут работать недостаточно хорошо или что они, наоборот, будут работать очень хорошо?» [43].
Редактирование генома человека открыло теоретическую возможность не только лечить генетические заболевания, но и создавать людей с желаемыми чертами. Сразу возродились забытые после Второй мировой войны идеи создания «надчеловека» и идеи эвгеники — учения о улучшении человеческой породы, которое было предложено Фрэнсисом Гальтоном (Francis Galton), двоюродным братом Чарльза Дарвина. И действительно, почему бы не создать более совершенных людей: более умных, красивых, сильных? Хотя при этом неизбежно возникают идеи создания людей с определенным назначением, например, идеальных солдат: сильных, выносливых, без чувства боли и страха. Страшно подумать, какие могут быть последствия таких фантастических возможностей науки. Поэтому, конечно, люди относятся к успехам генетики с осторожностью.
К сожалению, а может и к счастью, мы не имеем достаточных знаний относительно генетики сложных человеческих признаков. Возможно, генетика вообще не играет решающей роли в формировании таких признаков. Однако многие видят в технологии CRISPR/Cas9 первый шаг к созданию новой расы людей — генных мутантов, предсказывают появление зомби, смешение видов и всеобщий генный апокалипсис.
В докладе по оценке мировых угроз для США от 9 февраля 2016 года директор национальной разведки Джеймс Р. Клаппер (James R. Clapper) назвал редактирование генома потенциальным оружием массового уничтожения, поскольку биологические агенты или продукты, созданные в странах с нормативными или этическими стандартами, «отличающимися от западных», могут оказаться вредными. В документе утверждается, что распространение, низкая стоимость и ускоренные темпы развития технологии CRISPR/Cas9, преднамеренное или ненамеренное злоупотребление ею могут привести к далеко идущим последствиям для экономической и национальной безопасности США [44].
Одновременно простота технологии CRISPR/Cas9 и доступность в США реактивов для ее реализации дали возможность биохакерам вмешиваться в геном живых организмов в домашних условиях, не имея особых навыков и оборудования. Так, бывший ученый NASA Джозая Зайнер (Josiah Zayner), который имеет кандидатскую степень по биохимии Чикагского университета, заявил, что он является первым человеком, который попытался модифицировать свой собственный геном с помощью инновационной технологии редактирования генов CRISPR. По словам Зайнера, он начал экспериментировать с CRISPR в своем гараже летом 2016 года, вводя себе ген GFP, который вызывает свечение медуз. Сам он не начал светиться, но биопсия показала, что новый ген присутствует в его клетках. Компания Зайнера The Odin занимается продажей комплектов «Измените свои гены сами» стоимостью в $20, однако FDA запретило распространение этого продукта, назвав его мошенническим. Теперь биохакер предлагает клиентам покупать инструменты для генного редактирования растений и животных. Таких случаев довольно много: подростки, студенты, генетики-любители пытались применять технологию CRISPR для того, чтобы увеличить собственные мышцы, избавиться от герпеса или вылечить СПИД, однако эти попытки были безуспешными. Неконтролируемое распространение технологии CRISPR представляет значительную опасность из-за возможности создания биологического оружия и угрозы биотерроризма. Исследователи из Университета Альберты в Эдмонтоне (Канада) воссоздали с нуля вымерший вирус чумы. Они приобрели у коммерческой компании фрагменты ДНК, перекрывающиеся, соединили их вместе и ввели в клетки, зараженные другим типом поксвируса (осповируса).
Список использованной литературы [REFERENCES]
1. Meselson M., Yuan R. DNA restriction enzyme from E. coli. Nature. 1968. 217(5134): 1110–1114. DOI: https://doi. org/10.1038/2171110a0
2. Weiss B., Richardson C.C. Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid, I. Repair of single-strand breaks in DNA by an enzyme system from Escherichia coli infected with T4 bacteriophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. 57(4): 1021–1028. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.57.4.1021
3. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011. 471(7340): 602– 607. DOI: https://doi.org/10.1038/nature09886
4. Westra E.R., Semenova E., Datsenko K.A., Jackson R.N., Wiedenheft B., Severinov K., Brouns S.J. Type I-E CRISPR-cas systems discriminate target from non-target DNA through base pairing-independent PAM recognition. PLoS Genet. 2013. 9(9): e1003742. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003742
5. Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M., Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 1987. 169(12): 5429–5433. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.169.12.5429-5433.1987
6. Nakata A., Amemura M., Makino K. Unusual nucleotide arrangement with repeated sequences in the Escherichia coli K-12 chromosome. J. Bacteriol. 1989. 171(6): 3553–3556. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.171.6.3553-3556.1989
7. Groenen P.M., Bunschoten A.E., van Soolingen D., van Embden J.D. Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method. Mol. Microbiol. 1993. 10(5): 1057–1065. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1993.tb00976.x
8. Mojica F.J., Díez-Villaseñor C., Soria E., Juez G. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of archaea, bacteria and mitochondria. Mol. Microbiol. 2000. 36(1): 244–246. DOI: https://doi.org/10.1046/ j.1365-2958.2000.01838.x
9. Jansen R., Embden J.D., Gaastra W., Schouls L.M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 2002. 43(6): 1565–1575. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x
10. Mojica F.J., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of Molecular Evolution. 2005. 60(2): 174–182. DOI: https://doi. org/10.1007/s00239-004-0046-3
11. Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 2005. 151(3): 653–663. DOI: https://doi.org/10.1099/mic.0.27437-0
12. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S.D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology. 2005. 151(8): 2551–2561. DOI: https://doi. org/10.1099/mic.0.28048-0
13. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D.A., Horvath P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007. 315(5819): 1709–1712. DOI: https://doi. org/10.1126/science.1138140
14. Brouns S.J., Jore M.M., Lundgren M., Westra E.R., Slijkhuis R.J., Snijders A.P., Dickman M.J., Makarova K.S., Koonin E.V., van der Oost J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 2008. 321(5891): 960–964. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1159689
15. Marraffini L.A., Sontheimer E.J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 2008. 322(5909): 1843–1845. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1165771
16. Sontheimer E., Marraffini L. Target DNA interference with crRNA. U.S. Provisional Patent Application 61/009, 317, filed September 23, 2008; later published as US2010/0076057 (abandoned).
17. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012. 337(6096): 816–821. DOI: https://doi.org/10.1126/ science.1225829
18. Gasiunas G., Barrangou R., Horvath P., Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. 109: E2579–E2586. DOI: https://doi. org/10.1073/pnas.1208507109
19. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., Norville J.E., Church G.M. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013. 339(6121): 823–826. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1232033
20. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013. 339(6121): 819–823. DOI: https://doi. org/10.1126/science.1231143
21. Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. 2013. 31(3): 230–232. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.2507
22. Meganuclease. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Meganuclease
23. O’Connell M.R., Oakes B.L., Sternberg S.H., East-Seletsky A., Kaplan M., Doudna J.A. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 2014. 516(7530): 263–266. DOI: https://doi.org/10.1038/nature13769
24. Nelles D.A., Fang M.Y., O’Connell M.R., Xu J.L., Markmiller S.J., Doudna J.A., Yeo G.W. Programmable RNA tracking in live cells with CRISPR/Cas9. Cell. 2016. 165(2): 488–496. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.02.054
25. Vandenberghe L.H. Addgene: molecular therapy interview with Melina Fan and Karen Guerin. https://www. cell.com/molecular-therapy-family/molecular-therapy/fulltext/S1525-0016(18)30582-3 DOI: https://doi. org/10.1016/j.ymthe.2018.12.001
26. Brown K.V. Why CRISPR-edited food may be in supermarkets sooner than you think. https://gizmodo.com/whycrispr-edited-food-may-be-in-supermarkets-sooner-th-1822025033
27. Lee J., Wang F. Gene-edited baby by Chinese scientist: the opener of the pandora’s box. Science Insights. 2018. 2018:e000178. DOI: https://doi.org/10.15354/si.18.co015
28. Reardon S. CRISPR gene-editing creates wave of exotic model organisms. Nature. 2019. 568(7753): 441–442. DOI: https://doi.org/10.1038/d41586-019-01300-9
29. Wade N. Genes color a butterfly’s wings. Now scientists want to do it themselves. https://www.nytimes. com/2017/09/18/science/butterfly-wing-color-patterns-gene-editing.html
30. Qi L.S., Larson M.H., Gilbert L.A., Doudna J.A., Weissman J.S., Arkin A.P., Lim W.A. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013. 152(5): 1173–1183. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.cell.2013.02.022
31. Kungulovski G., Jeltsch A. Epigenome editing: state of the art, concepts, and perspectives. Trends Genet. 2016. 32(2): 101–113. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tig.2015.12.001
32. Pefanis E., Wang J.G., Rothschild G., Lim J., Kazadi D., Sun J.B., Federation A., Chao J., Elliott O., Liu Z.P., Economides A.N., Bradner J.E., Rabadan R., Basu U. RNA exosome-regulated long non-coding RNA transcription controls super-enhancer activity. Cell. 2015. 161(4): 774–789. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.04.034
33. Elling R., Chan J., Fitzgerald K.A. Emerging role of long noncoding RNAs as regulators of innate immune cell development and inflammatory gene expression. Eur. J. Immunol. 2016. 46(3): 504–512. DOI: https://doi.org/10.1002/ eji.201444558
34. Chen B., Gilbert L.A., Cimini B.A., Schnitzbauer J., Zhang W., Li G.W., Park J., Blackburn E.H., Weissman J.S., Qi L.S., Huang B. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 2013. 155(7): 1479–1491. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12.001
35. Hajian R., Balderston S., Tran T., deBoer T., Etienne J., Sandhu M., Wauford N.A., Chung J.Y., Nokes J., Athaiya M., Paredes J., Peytavi R., Goldsmith B., Murthy N., Conboy I.M., Aran K. Detection of unamplified target genes via CRISPR-Cas9 immobilized on a graphene field-effect transistor. Nat. Biomed. Eng. 2019. 3(6): 427–437. DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-019-0371-x
36. CRISPR’s future for point-of-care diagnostics. https://www.diagnosticsworldnews.com/news/2020/02/18/ crispr%27s-future-for-point-of-care-diagnostics
37. List of awards and honors received by Jennifer Doudna. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_awards_ and_honors_received_by_Jennifer_Doudna
38. Niu Y., Shen B., Cui Y., Chen Y., Wang J., Wang L., Kang Y., Zhao X., Si W., Li W., Xiang A.P., Zhou J., Guo X., Bi Y., Si C., Hu B., Dong G., Wang H., Zhou Z., Li T., Tan T., Pu X., Wang F., Ji S., Zhou Q., Huang X., Ji W., Sha J. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014. 156(4): 836–843. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.027
39. Shalem O., Sanjana N.E., Hartenian E., Shi X., Scott D.A., Mikkelsen T.S., Heckl D., Ebert B.L., Root D.E., Doench J.G., Zhang F. Genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screening in human cells. Science. 2014. 343(6166): 84–87. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1247005
40. Raphael B.J., Dobson J.R., Oesper L., Vandin F. Identifying driver mutations in sequenced cancer genomes: computational approaches to enable precision medicine. Genome Med. 2014. 6(1): 5. DOI: https://doi.org/10.1186/gm524
41. Wang T., Wei J.J., Sabatini D.M., Lander E.S. Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system. Science. 2014. 343(6166): 80–84. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1246981
42. Baltimore D., Berg P., Botchan M., Carroll D., Charo R.A., Church G., Corn J.E., Daley G.Q., Doudna J.A., Fenner M., Greely H.T., Jinek M., Martin G.S., Penhoet E., Puck J., Sternberg S.H., Weissman J.S., Yamamoto K.R. Biotechnology. A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification. Science. 2015. 348(6230): 36–38. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aab1028
43. Vogel G. Bioethics. Embryo engineering alarm. Science. 2015. 347(6228): 1301. DOI: https://doi.org/10.1126/science.347.6228.1301
44. Clapper J.R. Worldwide threat assessment of the US intelligence community. https://www.dni.gov/files/documents/SASC_Unclassified_2016_ATA_SFR_FINAL.pdf
45. Baumgaertner E. As D.I.Y. gene editing gains popularity, ‘Someone is going to get hurt’. https://www.nytimes. com/2018/05/14/science/biohackers-gene-editing-virus.html
46. Liang P., Xu Y., Zhang X., Ding C., Huang R., Zhang Z., Lv J., Xie X., Chen Y., Li Y., Sun Y., Bai Y., Songyang Z., Ma W., Zhou C., Huang J. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015. 6(5): 363–372. DOI: https://doi.org/10.1007/s13238-015-0153-5
47. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y., Gootenberg J.S., Konermann S., Trevino A.E., Scott D.A., Inoue A., Matoba S., Zhang Y., Zhang F. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 2013. 154(6): 1380–1389. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.08.021
48. Fu Y., Sander J.D., Reyon D., Cascio V.M., Joung J.K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol. 2014. 32(3): 279–284. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.2808
49. Kleinstiver B.P., Prew M.S., Tsai S.Q., Topkar V.V., Nguyen N.T., Zheng Z., Gonzales A.P., Li Z., Peterson R.T., Yeh J.R., Aryee M.J., Joung J.K. Engineered CRISPR/Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 2015. 523(7561): 481–485. DOI: https://doi.org/10.1038/nature14592
50. Guilinger J.P., Thompson D.B., Liu D.R. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014. 32(6): 577–582. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.2909
51. Slaymaker I.M., Gao L., Zetsche B., Scott D.A., Yan W.X., Zhang F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 2016. 351(6268): 84–88. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aad5227
52. Kleinstiver B.P., Pattanayak V., Prew M.S., Tsai S.Q., Nguyen N.T., Zheng Z., Joung J.K. High-fidelity CRISPR/Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 2016. 529(7587): 490–495. DOI: https://doi. org/10.1038/nature16526
53. Zhou W., Deiters A. Conditional Control of CRISPR/Cas9 Function. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2016. 55(18): 5394–5399. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.201511441
54. Byrne J.A., Pedersen D.A., Clepper L.L., Nelson M., Sanger W.G., Gokhale S., Wolf D.P., Mitalipov S.M. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature. 2007. 450(7169): 497–502. DOI: https://doi. org/10.1038/nature06357
55. Tachibana M., Sparman M., Sritanaudomchai H., Ma H., Clepper L., Woodward J., Li Y., Ramsey C., Kolotushkina O., Mitalipov S. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 2009. 461(7262): 367–372. DOI: https://doi.org/10.1038/nature08368
56. Tachibana M., Amato P., Sparman M., Gutierrez N.M., Tippner-Hedges R., Ma H., Kang E., Fulati A., Lee H.S., Sritanaudomchai H., Masterson K., Larson J., Eaton D., Sadler-Fredd K., Battaglia D., Lee D., Wu D., Jensen J., Patton P., Gokhale S., Stouffer R.L., Wolf D., Mitalipov S. Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell. 2013. 153(6): 1228–1238. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.06.042
57. Kang E., Wu J., Gutierrez N.M., Koski A., Tippner-Hedges R., Agaronyan K., Platero-Luengo A., Martinez-Redondo P., Ma H., Lee Y., Hayama T., Van Dyken C., Wang X., Luo S., Ahmed R., Li Y., Ji D., Kayali R., Cinnioglu C., Olson S., Jensen J., Battaglia D., Lee D., Wu D., Huang T., Wolf D.P., Temiakov D., Belmonte J.C., Amato P., Mitalipov S. Mitochondrial replacement in human oocytes carrying pathogenic mitochondrial DNA mutations. Nature. 2016. 540(7632): 270–275. DOI: https://doi.org/10.1038/nature20592
58. Ma H., Marti-Gutierrez N., Park S.W., Wu J., Lee Y., Suzuki K., Koski A., Ji D., Hayama T., Ahmed R., Darby H., Van Dyken C., Li Y., Kang E., Park A.R., Kim D., Kim S.T., Gong J., Gu Y., Xu X., Battaglia D., Krieg S.A., Lee D.M., Wu D.H., Wolf D.P., Heitner S.B., Belmonte J.C.I., Amato P., Kim J.S., Kaul S., Mitalipov S. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature. 2017. 548(7668): 413–419. DOI: https://doi.org/10.1038/nature23305
59. Second woman carrying gene-edited baby, Chinese authorities confirm. https://www.theguardian.com/science/2019/jan/22/second-woman-carrying-gene-edited-baby-chinese-authorities-confirm
60. CRISPR scientist gets three years of jail time for creating gene-edited babies. https://gizmodo.com/crispr-scientistgets-three-years-of-jail-time-for-crea-1840724277
61. Act now on CRISPR babies. Nature. 2019. 570(137). DOI: https://doi.org/10.1038/d41586-019-01786-3
62. Collins F.S. NIH Director on Human Gene Editing: ‘We Must Never Allow our Technology to Eclipse our Humanity’. https://www.discovermagazine.com/health/nih-director-on-human-gene-editing-we-must-never-allow-ourtechnology-to
63. Gene mutation meant to protect from HIV ‘raises risk of early death’. https://www.theguardian.com/science/2019/ jun/03/gene-mutation-protect-hiv-raises-risk-early-death
64. Andorno R., Yamin A.E. The right to design babies? Human rights and bioethics. https://www.openglobalrights.org/ the-right-to-design-babies-human-rights-and-bioethics/
65. Citorik R.J., Mimee M., Lu T.K. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nat. Biotechnol. 2014. 32(11): 1141–1145. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.3011
66. Bikard D., Euler C.W., Jiang W., Nussenzweig P.M., Goldberg G.W., Duportet X., Fischetti V.A., Marraffini L.A. Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials. Nat. Biotechnol. 2014. 32(11): 1146– 1150. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.3043
67. Yosef I., Manor M., Kiro R., Qimron U. Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. 112(23): 7267–7272. DOI: https://doi.org/10.1073/ pnas.1500107112
68. Gantz V.M., Jasinskiene N., Tatarenkova O., Fazekas A., Macias V.M., Bier E., James A.A. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. 112(49): E6736–E6743. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1521077112
69. Gantz V.M., Bier E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 2015. 348(6233): 442–444. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaa5945
70. Stokstad E. Genetically engineered moths can knock down crop pests, but will they take off? https://www.sciencemag.org/news/2020/01/genetically-engineered-moths-can-knock-down-crop-pests-will-they-take DOI: https://doi.org/10.1126/science.abb1078
71. Yang L., Güell M., Niu D., George H., Lesha E., Grishin D., Aach J., Shrock E., Xu W., Poci J., Cortazio R., Wilkinson R.A., Fishman J.A., Church G. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science. 2015. 350(6264): 1101–1104. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aad1191
72. Niu D., Wei H.J., Lin L., George H., Wang T., Lee I.H., Zhao H.Y., Wang Y., Kan Y., Shrock E., Lesha E., Wang G., Luo Y., Qing Y., Jiao D., Zhao H., Zhou X., Wang S., Wei H., G ell M., Church G.M., Yang L. Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9. Science. 2017. 357(6357): 1303–1307. DOI: https://doi. org/10.1126/science.aan4187
73. Gene editing spurs hope for transplanting pig organs into humans. https://www.nytimes.com/2017/08/10/health/ gene-editing-pigs-organ-transplants.html
74. Nunes Dos Santos R.M., Carneiro D’Albuquerque L.A., Reyes L.M., Estrada J.L., Wang Z.Y., Tector M., Tector A.J. CRISPR/Cas and recombinase-based human-to-pig orthotopic gene exchange for xenotransplantation. J. Surg. Res. 2018. 229: 28–40. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jss.2018.03.051
75. Dong C., Qu L., Wang H., Wei L., Dong Y., Xiong S. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication. Antiviral Res. 2015. 118: 110–117. DOI: https://doi.org/10.1016/j. antiviral.2015.03.015
76. Kaminski R., Chen Y., Fischer T., Tedaldi E., Napoli A., Zhang Y., Karn J., Hu W., Khalili K. Elimination of HIV-1 genomes from human T-lymphoid cells by CRISPR/Cas9 gene editing. Sci. Rep. 2016. 6: 22555. DOI: https://doi. org/10.1038/srep22555
77. Wang Z., Pan Q., Gendron P., Zhu W., Guo F., Cen S., Wainberg M.A., Liang C. CRISPR/Cas9-derived mutations both inhibit HIV-1 replication and accelerate viral escape. Cell Rep. 2016. 15(3): 481–489. DOI: https://doi. org/10.1016/j.celrep.2016.03.042
78. Kang X., He W., Huang Y., Yu Q., Chen Y., Gao X., Sun X., Fan Y. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J. Assist. Reprod. Genet. 2016. 33(298): 1–8. DOI: https://doi.org/10.1007/s10815-016-0710-8
79. Xu L., Yang H., Gao Y., Chen Z., Xie L., Liu Y., Liu Y., Wang X., Li H., Lai W., He Y., Yao A., Ma L., Shao Y., Zhang B., Wang C., Chen H., Deng H. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. 2017. 25(8): 1782–1789. DOI: https://doi.org/10.1016/j. ymthe.2017.04.027
80. Dash P.K., Kaminski R., Bella R., Su H., Mathews S., Ahooyi T.M., Chen C., Mancuso P., Sariyer R., Ferrante P., Donadoni M., Robinson J.A., Sillman B., Lin Z., Hilaire J.R., Banoub M., Elango M., Gautam N., Mosley R.L., Poluektova L.Y., McMillan J., Bade A.N., Gorantla S., Sariyer I.K., Burdo T.H., Young W.B., Amini S., Gordon J., Jacobson J.M., Edagwa B., Khalili K., Gendelman H.E. Sequential LASER ART and CRISPR treatments eliminate HIV-1 in a subset of infected humanized mice. Nat. Commun. 2019. 10(1): 2753. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019- 10366-y
81. Yuan M., Webb E., Lemoine N.R., Wang Y. CRISPR-Cas9 as a powerful tool for efficient creation of oncolytic viruses. Viruses. 2016. 8(3): E72. DOI: https://doi.org/10.3390/v8030072
82. Kennedy E.M., Kornepati A.V., Goldstein M., Bogerd H.P., Poling B.C., Whisnant A.W., Kastan M.B., Cullen B.R. Inactivation of the human papillomavirus E6 or E7 gene in cervical carcinoma cells by using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided endonuclease. J. Virol. 2014. 88(20): 11965–11972. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.01879-14
83. Miller J.F., Sadelain M. The journey from discoveries in fundamental immunology to cancer immunotherapy. Cancer Cell. 2015. 27(4): 439–449. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2015.03.007
84. Roth T.L., Puig-Saus C., Yu R., Shifrut E., Carnevale J., Li P.J., Hiatt J., Saco J., Krystofinski P., Li H., Tobin V., Nguyen D.N., Lee M.R., Putnam A.L., Ferris A.L., Chen J.W., Schickel J.N., Pellerin L., Carmody D., Alkorta-Aranburu G., Del Gaudio D., Matsumoto H., Morell M., Mao Y., Cho M., Quadros R.M., Gurumurthy C.B., Smith B., Haugwitz M., Hughes S.H., Weissman J.S., Schumann K., Esensten J.H., May A.P., Ashworth A., Kupfer G.M., Greeley S.A.W., Bacchetta R., Meffre E., Roncarolo M.G., Romberg N., Herold K.C., Ribas A., Leonetti M.D., Marson A. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature. 2018. 559(7714): 405–409. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-018-0326-5
85. Zaroff S. CAR T-Cell therapies with a bispecific twist. Genet. Eng. Biotech. N. 2018. 38(13). https://www.genengnews.com/magazine/car-t-cell-therapies-with-a-bispecific-twist/ DOI: https://doi.org/10.1089/gen.38.13.09
86. Kojima R., Scheller L., Fussenegger M. Nonimmune cells equipped with T-cell-receptor-like signaling for cancer cell ablation. Nature Chemical Biology. 2018. 14: 42–49. DOI: https://doi.org/10.1038/nchembio.2498
87. Montel-Hagen A., Seet C.S., Li S., Chick B., Zhu Y., Chang P., Tsai S., Sun V., Lopez S., Chen H.C., He C., Chin C.J., Casero D., Crooks G.M. Organoid-induced differentiation of conventional T cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2019. 24(3): 376–389.e8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.12.011
88. White M.K., Khalili K. CRISPR/Cas9 and cancer targets: future possibilities and present challenges. Oncotarget. 2016. 7(11): 12305–12317. DOI: https://doi.org/10.18632/oncotarget.7104
89. Cyranoski D. CRISPR gene-editing tested in a person for the first time. Nature News. 2016. 539(7630): 479. DOI: https://doi.org/10.1038/nature.2016.20988
90. New cancer drug targets accelerate path to precision medicine. https://www.drugtargetreview.com/news/42672/ new-cancer-drug-targets-accelerate-path-to-precision-medicine/
91. Booth C., Gaspar H.B., Thrasher A.J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends Mol. Med. 2016. 22(4): 317–327. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molmed.2016.02.002
92. Guan Y., Ma Y., Li Q., Sun Z., Ma L., Wu L., Wang L., Zeng L., Shao Y., Chen Y., Ma N., Lu W., Hu K., Han H., Yu Y., Huang Y., Liu M., Li D. CRISPR/Cas9-mediated somatic correction of a novel coagulator factor IX gene mutation ameliorates hemophilia in mouse. EMBO Mol. Med. 2016. 8(5): 477–488. DOI: https://doi.org/10.15252/ emmm.201506039
93. Nelson C.E., Hakim C.H., Ousterout D.G., Thakore P.I., Moreb E.A., Castellanos Rivera R.M., Madhavan S., Pan X., Ran F.A., Yan W.X., Asokan A., Zhang F., Duan D., Gersbach C.A. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2016. 351(6271): 403–407. DOI: https://doi.org/10.1126/ science.aad5143
94. DeWitt M.A., Magis W., Bray N.L., Wang T., Berman J.R., Urbinati F., Heo S.J., Mitros T., Mu oz D.P., Boffelli D., Kohn D.B., Walters M.C., Carroll D., Martin D.I., Corn J.E. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci. Transl. Med. 2016. 8(360): 360ra134. DOI: https://doi. org/10.1126/scitranslmed.aaf9336
95. CRISPR patent fight turns ugly as UC accuses Broad researchers of lying about claims. https://www.genomeweb. com/business-news/crispr-patent-fight-turns-ugly-uc-accuses-broad-researchers-lying-about-claims
96. Sanders R. UC rings out 2019 with its 20th CRISPR patent. https://news.berkeley.edu/2019/12/31/uc-rings-out2019-with-its-20th-crispr-patent/
97. Craven L., Herbert M., Murdoch A., Murphy J., Lawford Davies J., Turnbull D.M. Research into policy: a brief history of mitochondrial donation. Stem Cells. 2016. 34(2): 265–267. DOI: https://doi.org/10.1002/stem.2221
98. Callaway E. UK scientists gain license to edit genes in human embryos. Nature News. 2016. 530(7588): 18. DOI: https://doi.org/10.1038/nature.2016.19270
99. Mills P. Genome editing and human reproduction: The Nuffield Council on Bioethics’ report. https://www.bionews. org.uk/page_137343
100. Becker R. The ‘three-parent baby’ fertility doctor needs to stop marketing the procedure, FDA says. https://www. theverge.com/2017/8/5/16100680/three-parent-baby-fertility-doctor-fda-letter-violations
101. This fertility doctor is pushing the boundaries of human reproduction, with little regulation. https://www.washingtonpost.com/national/health-science/this-fertility-doctor-is-pushing-the-boundaries-of-human-reproductionwith-little-regulation/2018/05/11/ea9105dc-1831-11e8-8b08-027a6ccb38eb_story.html
102. Sangamo ZFN Technology Platform. 2018. https://www.sangamo.com/application/files/6915/3002/3307/IRTechnology_v06.12.18_1.pdf
103. Haridy R. First CRISPR therapy administered in landmark human trial. https://newatlas.com/crispr-trial-underway-vertex-gene-therapy/58643/
104. The Future of CRISPR. http://www.fwreports.com/dossier/the-future-of-crispr/#.XmgL-kFR2Uk
105. «Tegsedi»: an oligonucleotide drug against familial amyloid polyneuropathy. (in Russian). https://mosmedpreparaty.ru/news/16897 [«Тегседи»: олигонуклеотидное лекарство против семейной амилоидной полинейропатии.]
106. Stolberg S.G. The biotech death of Jesse Gelsinger. http://www.nytimes.com/1999/11/28/magazine/the-biotechdeath-of-jesse-gelsinger.html
107. Bersenev A. The history of gene therapy drugs approval on the market. http://stemcellassays.com/2011/12/history-gene-therapy-drugs-approval-market/
108. Morrison C. 1-million price tag set for Glybera gene therapy. Nature Biotechnology. 2015. 33: 217–218. DOI: https:// doi.org/10.1038/nbt0315-217
109. Kozubek J. Who will pay for CRISPR? https://www.statnews.com/2017/06/26/crispr-insurance-companies-pay/
110. Talimogene laherparepvec. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Talimogene_laherparepvec
111. Kegel M. Imlygic-Yervoy combo twice as effective as Yervoy in fighting melanoma, study finds. https://immunooncologynews.com/2017/10/12/melanoma-investigational-therapy-combo-imlygic-yervoy-twice-as-effective-yervoy-alone-study-finds/
112. Mullin E. A gene therapy that cures a rare genetic disease just got its first customer, a year after it was approved. http://www.businessinsider.com/gsks-strimvelis-gene-therapy-used-for-the-first-time-after-approval-2017-5
113. Al Idrus A. Orchard Therapeutics’ 2019: Pipeline progress, breaking ground on its $90M manufacturing site. https://www.fiercebiotech.com/biotech/orchard-therapeutics-2019-pipeline-progress-breaking-ground-its-90mmanufacturing-site
114. Sampson T.R., Saroj S.D., Llewellyn A.C., Tzeng Y.L., Weiss D.S. A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature. 2013. 497(7448): 254–257. DOI: https://doi.org/10.1038/nature12048
115. Koonin E.V., Krupovic M. Evolution of adaptive immunity from transposable elements combined with innate immune systems. Nat. Rev. Genet. 2015. 16(3): 184–192. DOI: https://doi.org/10.1038/nrg3859
116. Wright A.V., Liu J.J., Knott G.J., Doxzen K.W., Nogales E., Doudna J.A. Structures of the CRISPR genome integration complex. Science. 2017. 357(6356): 1113–1118. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aao0679
117. Jiang F., Taylor D.W., Chen J.S., Kornfeld J.E., Zhou K., Thompson A.J., Nogales E., Doudna J.A. Structures of a CRISPR/Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. Science. 2016. 351(6275): 867–871. DOI: https://doi. org/10.1126/science.aad8282
118. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Slaymaker I.M., Makarova K.S., Essletzbichler P., Volz S.E., Joung J., van der Oost J., Regev A., Koonin E.V., Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015. 163(3): 759–771. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038
119. Gleeson A., Sawyer A. CRISPR/Cas9: the gold standard of genome editing? Biotechniques. 2018. 64(6): 239–243. DOI: https://doi.org/10.2144/btn-2018-0066
120. Sansbury B.M., Wagner A.M., Nitzan E., Gabi T., Kmeic E.B. CRISPR-directed in vitro gene editing of plasmid DNA catalyzed by Cpf1 (Cas12a) nuclease and a mammalian cell-free extract. CRISPR J. 2018. 1(2): 191–202. DOI: https://doi.org/10.1089/crispr.2018.0006
121. Burstein D., Harrington L.B., Strutt S.C., Probst A.J., Anantharaman K., Thomas B.C., Doudna J.A., Banfield J.F. New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes. Nature. 2017. 542(7640): 237–241. DOI: https://doi. org/10.1038/nature21059
122. Hegge J.W., Swarts D.C., van der Oost J. Prokaryotic Argonaute proteins: novel genome-editing tools? Nat. Rev. Microbiol. 2017. 16(1): 5–11. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro.2017.73
123. Harrington L.B., Burstein D., Chen J.S., Paez-Espino D., Ma E., Witte I.P., Cofsky J.C., Kyrpides N.C., Banfield J.F., Doudna J.A. Programmed DNA Destruction by Miniature CRISPR-Cas14 Enzymes. Science. 2018. 362(6416): 839–842. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aav4294
124. Abudayyeh O.O., Gootenberg J.S., Konermann S., Joung J., Slaymaker I.M., Cox D.B., Shmakov S., Makarova K.S., Semenova E., Minakhin L., Severinov K., Regev A., Lander E.S., Koonin E.V., Zhang F. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016. 353(6299): aaf5573. DOI: https://doi. org/10.1126/science.aaf5573
125. Smargon A.A., Cox D.B., Pyzocha N.K., Zheng K., Slaymaker I.M., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.A., Essletzbichler P., Shmakov S., Makarova K.S., Koonin E.V., Zhang F. Cas13b is a type VI-B CRISPR-associated RNAguided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28. Mol. Cell. 2017. 65(4): 618–630.e7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023
126. Yan W.X., Chong S., Zhang H., Makarova K.S., Koonin E.V., Cheng D.R., Scott D.A. Cas13d is a compact RNAtargeting type VI CRISPR effector positively modulated by a WYL-domain-containing accessory protein. Mol Cell. 2018. 70(2): 327–339. DOI: https://doi.org/10.1016 / j.molcel.2018.02.028
127. Chatterjee P., Jakimo N., Jacobson J.M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Sci. Adv. 2018. 4(10): eaau0766. DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.aau0766
128. New DNA ‘shredder’ technique goes beyond CRISPR’s scissors. https://www.drugtargetreview.com/news/42518/ new-dna-shredder-technique-goes-beyond-crisprs-scissors/
129. Sadhu M.J., Bloom J.S., Day L., Siegel J.J., Kosuri S., Kruglyak L. Highly parallel genome variant engineering with CRISPR-Cas9. Nat. Genet. 2018. 50(4): 510–514. DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-018-0087-y
130. Enzyme fragment complementation assay technology. https://www.discoverx.com/technologies-platforms/enzyme-fragment-complementation-technology
131. Biosensor development using CRISPR to quantify endogenous protein modulated by targeted protein degraders. http://www.healthtech.com/eurofins-biosensor-Development-using-crispr/
132. Zengerle M., Chan K.-H., Ciulli A. Selective small molecule induced degradation of the BET bromodomain protein BRD4. ACS Chem. Biol. 2015. 10(8): 1770. DOI: https://doi.org/10.1021/acschembio.5b00216
133. Single-stranded DNA synthesis service. https://www.genscript.com/new-single-stranded-dna-synthesis-service. html
134. Strecker J., Ladha A., Gardner Z., Schmid-Burgk J.L., Makarova K.S., Koonin E.V., Zhang F. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science. 2019. 365(6448): 48–53. DOI: https://doi.org/10.1126/ science.aax9181
135. Stafforst T., Schneider M.F. An RNA-deaminase conjugate selectively repairs point mutations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2012. 51(44): 11166–11169. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.201206489
136. Reardon S. Step aside CRISPR, RNA editing is taking off. Nature. 2020. 578(7793): 24–27. DOI: https://doi. org/10.1038/d41586-020-00272-5 137. Pennisi E. The CRISPR craze. Science. 2013. 341(6148): 833–836. DOI: https://doi.org/10.1126/science.341. 6148.833
138. Gene editing like CRISPR is too important to be left to scientists alone. https://www.theguardian.com/commentisfree/2019/oct/22/gene-editing-crispr-scientists
